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NetMHCpan软件用于预测肽段与MHC I型分子的亲和性，最新版本为v4.0, 基于人工神经网络算法，以180000多个定量结合数据和MS衍生的MHC洗脱配体的组合为训练集构建模型。结合亲和力数据来自人，小鼠，猪等多个物种的MHC分子，MS洗脱的配体数据来自55个人和小鼠的HLA等位基因。

直接上传fasta格式的蛋白序列就可以了， 示意如下

第一步上传涵盖了体细胞突变位点的氨基酸序列，上传的氨基酸序列是突变之后的序列，不是野生型的蛋白质序列。

第二步选择切割肽段的方式，抗原通过抗原表位与MHC分子结合，MHC I型分子可以结合的抗原表位长度为8到11个氨基酸，对应这里的8-11mer，先将蛋白质序列切分成短的肽段之后在进行MHC分子亲和性的预测。

第三步选择HLA allel, 确定之后点击提交按钮即可。输出结果示意如下

列数很多，其中的Peptide就是从原始的输入序列中提取出的长度为8-11个氨基酸的肽段，Pos对应肽段的在原始序列上的起始位置，第一个位置从0开始计数；Core对应与MHC结合的肽段序列，和blast类似，允许插入和缺失，%Rank代表该肽段是一个天然存在的肽段的可能性，数值越小越好，最后一列的BindLevel代表亲和力的强弱水平，SB表示strong binding, WB表示weak bingding。每一列的详细解释参见以下链接

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/output.php

官方按照Rank值来筛选结果，默认情况下rank小于0.5的定义为强亲和性,rank值在0.5到2之间的定义为弱亲和性。通过该软件可以从突变之后的氨基酸序列中预测到与MHC I型分子亲和力较强的肽段，作为候选的肿瘤新抗原。

为了进一步简化分析，相关的数据分析pipeline被开发出来，只需要提供肿瘤患者的体细胞突变数据和HLA分型结果即可，软件自动提取突变氨基酸序列，并进行NetMHCpan分析，类似的软件有很多，NeoPredPipe软件就是其中之一，该软件的网址如下

https://github.com/MathOnco/NeoPredPipe

基本用法如下

python NeoPredPipe.py \
-I somatic.vcf \
-H hlatypes.txt \
-o ./ \
-n TestRun \
-c 1 2 -E 8 9 10

需要提供两个输入文件，-I指定体细胞突变的vcf文件，-H指定HLA分型结果文件。更多细节请参考该软件的官方文档。

通过上述的数据分析，可以快速定位出候选的新抗原，然而其中的假阳性率还是非常高的，后续还需要结合体外实验来进一步筛选和过滤。

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